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先週、完璧に機能したグラデーション メソッドを実行したばかりです。キャリブレーション標準はきれいに見えますが、サンプルのクロマトグラムでは 23.8 分に余分なピークが示されています。カラムを交換し、新しいバッファーを準備し、検出器をチェックします。ピークはまだそこにあります。次に、移動相に入る水を交換すると、アーティファクトは消えます。これが高速液体クロマトグラフィーの現実です。水の純度はあらゆる分離の根底にあり、それが変化するとメソッドもそれに伴って変化します。
水の純度は、ベースラインの安定性、ピークの形状、保持の再現性、および機器の寿命という 4 つの実際的な方法で HPLC データの品質に影響を与えます。関与する汚染物質は、有機分子、溶解イオン、粒子、微生物などである可能性があります。 1 種類の不純物が少量であっても、その濃度に比例しない結果が生じる可能性があります。
HPLC に対する水純度の主な影響
HPLC システムでは、水は試薬であり、受動的バックグラウンドではありません。それは緩衝液を運び、サンプルを溶解し、検出器のバックグラウンドに寄与します。したがって、水中の不純物は分析信号に直接移動します。以下の表は、最も一般的な汚染物質とその影響をまとめたものです。
| 汚染物質 | 例またはソース | HPLCでの効果 |
|---|---|---|
| 溶解した有機物 | 腐植物質、可塑剤、洗浄残留物、溶剤蒸気 | UV吸収ゴーストピーク、ベースラインドリフト、保持変化 |
| 無機イオン | ナトリウム、塩化物、ケイ酸塩、微量金属 | 導電率の変化、イオンクロマトグラフィーおよびLC-MSにおける干渉、金属関連のピークブロードニング |
| 微粒子 | 樹脂の微粉、塵、沈殿物 | フリットの詰まり、背圧の上昇、ポンプシールの摩耗、ノイズの多いベースライン |
| 溶存ガス | 酸素、二酸化炭素、窒素 | 検出器内の気泡、ベースラインスパイク、pH ドリフト |
| 微生物 | 保存容器内の細菌とバイオフィルム | カラムの汚れ、フリットの詰まり、偽ピーク、メソッドの不安定性 |
これらの効果は理論上のものだけではありません。貯水池内の微生物のバイオフィルムは、紫外線を吸収する代謝産物を放出する可能性があり、そのフィルムが形成されると、貯水池が洗浄され消毒されるまでは水を交換するだけでは問題が解決しない可能性があります。
「HPLC グレード」とタイプ 1 水の実際の意味
ほとんどの分析方法では、タイプ 1 の仕様を満たす水が必要です。実際には、これは、摂氏 25 度での抵抗率が約 18.2 メグオーム センチメートル、導電率が 1 センチメートルあたり 0.055 マイクロジーメンス近く、有機炭素の総量が十分に低いため、水が目に見える UV または MS バックグラウンドを生成しないことを意味します。抵抗率だけでは十分ではありません。また、TOC レベル、粒子数、および一部のアプリケーションではケイ酸塩またはナトリウムの値も知る必要があります。
精製水の pH は有用な仕様ではありません。超純水には緩衝能力がほとんどなく、空気中の二酸化炭素をすぐに吸収するため、測定された約 5.6 の pH は単に溶解した CO2 を反映しているだけです。重要な pH は、準備する緩衝移動相の pH です。
水質要件も検出器によって異なります。 210 nm での UV 検出は、多くの炭素-酸素結合および炭素-窒素結合が吸収されるため、有機汚染に対して特に敏感です。 LC-MS では、イオン抑制や付加物の形成を避けるために、不揮発性不純物が非常に少ない水が必要です。蒸発検出器も同様に、不揮発性汚染によりバックグラウンド信号が上昇するため、影響を受けます。したがって、タイプ 1 水は、ほぼすべての HPLC アプリケーションの適切な出発点となります。
ボトル入りの HPLC グレードの水でも使用できますが、正しく保管し、取り扱う必要があります。分析証明書を確認し、ロット番号を記録してください。古い容器に生物の増殖がないとは決して考えないでください。
勾配溶出により水の不純物が見えるようになる
水の不純物は、グラジエント法で最も目立ちます。アイソクラティック実行では、UV 吸収性汚染物質によってベースラインがわずかに上昇するだけである可能性があります。グラジエントでは、最初は水の割合が高く、時間の経過とともに有機溶媒の割合が増加します。汚染物質はカラムのヘッドに滞留し、有機含有量が増加するにつれて溶出する可能性があります。これにより、ゴースト ピークやベースラインの変動が生じ、統合や定量が妨げられる可能性があります。
そのため、ブランク勾配は水質の最も簡単なチェックの 1 つです。サンプルを注入せずに正確なグラジエントを実行します。ブランクにピークが現れる場合は、移動相が疑われます。
水をきれいに保つための毎日の習慣
純粋な水は偶然に純粋なままになるわけではありません。以下の習慣により、HPLC の実践における最も一般的な問題を防ぐことができます。
- 新しいカートリッジ、動作する UV ランプ、および定期的な消毒を備えた浄化システムからの水を使用してください。
- 清潔な蓋付きの容器に水を集めます。システムの稼働中はコンテナを開いたままにしないでください。
- 水を数日間保管しないでください。移動相は可能な限り同日に淡水で調製してください。
- 部分的に満たされたリザーバーに真水を追加しないでください。リザーバーの内容物を補充するのではなく、交換してください。
- 分析に使用した波長でブランク グラジエントを実行し、結果を記録します。
- 比抵抗、TOC、および水の収集日を分析記録に記録します。
ボトル入りの水を使用する研究室にも、同じルールが適用されます。使用期限を確認し、使用後はすぐに容器を閉め、使い残した水はビーカーからボトルに戻さないでください。
添加剤は水の問題を方法の問題に変える
移動相に水だけが含まれることはほとんどありません。緩衝塩、酸、イオンペア試薬、およびいくつかの特殊な修飾剤が比較的低濃度で添加されます。水に微量の UV 吸収不純物が含まれている場合、それらの不純物は緩衝能力を変化させない可能性がありますが、それでも検出器の信号に現れる可能性があります。
イオン液体は、ピーク形状や選択性を改善するための移動相調整剤として使用されることがあります。どちらかを選択する場合は、同じ純度基準を適用する必要があります。たとえば、 1-エチル-3-メチルイミダゾリウム テトラフルオロボレート クロマトグラフィー研究に一般的なイオン液体です。すでにタイプ 1 の仕様を満たしている水に溶解する必要があります。そうしないと、添加剤が別の汚染源になります。これらの化合物の分離関連の特性を理解したい場合は、 分離プロセスにおけるイオン液体の動作の概要 実際の変数をカバーします。
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Zhejiang Ldet では、イオン液体と特殊化学薬品を製造しています。出発原料中の微量不純物が下流の性能に影響を与える可能性があることは、製造現場でわかっています。そのため、出荷前に水分含有量、残留ハロゲン化物、UV挙動をチェックします。 HPLC ラボにも同じ分野があり、文書化された仕様が付属する材料を選択します。たとえば、 1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート 純度データを使用して、検出方法と互換性があるかどうかを評価できます。
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- 残留ハロゲン化物含有量。ハロゲン化物はイオン交換分離や腐食に影響を与える可能性があるため。
- 水分含有量。水によって添加剤の有効濃度が変化するためです。
- UV スペクトルまたは UV カットオフにより、バックグラウンドの吸光度を予測できます。
- ロット間の一貫性。新しいロットが黙ってメソッドを変更するべきではないためです。
マテリアルをメソッドに適合させるのにヘルプが必要な場合は、次のことができます。 当社の技術チームと純度データおよびカスタム要件について話し合う .
メソッドの一部として水を処理する
HPLC における水の純度は 1 回限りの設定ではありません。これは毎日の変数であり、季節、保存ボトル、浄化システムの状態によって変化する可能性があります。タイプ 1 の水を使用し、TOC と比抵抗を確認し、適切に取り扱い、トレーサビリティのある添加剤を選択してください。ナノグラムの分析物に基づいて構築された方法では、水は決して「単なる水」ではありません。
